У аналізу з ДНК точність – стовідсоткова

У аналізу з ДНК точність – стовідсоткова

Полімеразна ланцюгова реакція – один із наймолодших і водночас точних методів лабораторної діагностики. Сьогодні він дозволяє виявляти різні бактеріальні та вірусні інфекції, діагностувати деякі генетичні захворювання, у тому числі і в пренатальному періоді, а також встановлювати батьківство. Його широко використовують у клінічних та біомедичних дослідженнях, мікробіології, криміналістиці, молекулярній археології.

Методика ПЦР
Будь-який організм, у тому числі й інфекційний агент, має свою неповторну послідовність генів, що зберігається у молекулі ДНК. Кожен ген, своєю чергою, «записаний» у ній у вигляді певної послідовності чотирьох типів нуклеотидів: аденіну, гуаніну, тиміну, цитозину. Молекула ДНК складається з двох ниток, які обвивають один одного у вигляді спіралі, в якій аденін однієї нитки завжди пов'язаний водневим зв'язком з тиміном інший, а гуанін – з цитозином. Така сполука називається комплементарною. Щоб провести полімеразну ланцюгову реакцію (ПЦР), до досліджуваного зразка додають генетичні проби – праймери. Це штучно синтезовані послідовності з 15-30 нуклеотидів, здатні створювати комплементарні зв'язки з кінцями ділянки ДНК, що шукається. Для виявлення збудників хвороб використовують різні праймери. У результаті ПЦР біологічний матеріал спочатку нагрівають до температури близько 90–95 °З, щоб подвійна спіраль ДНК розплелася, тобто. розділилася на окремі нитки. Потім охолоджують до 40-60 °С. При цій температурі відбувається так званий відпал - приєднання праймерів до фрагментів ДНК, що шукаються, якщо вони присутні в зразку. Наступний етап ПЦР, синтез ланцюгів ДНК, відбувається за температури 72 °С. Кожна з ниток ДНК стає матрицею, де спеціальний фермент ДНК- полимераза за принципом комплементарності добудовує другу нитку нуклеїнової кислоти. Згортання двониткової молекули ДНК у спіраль відбувається автоматично.Таким чином, метод імітує у пробірці природну реплікацію ДНК. У результаті кожного циклу ПЦР фрагмент шуканої ДНК подвоюється, а сам цикл повторюється стільки разів, скільки це необхідно. Сучасні прилади, що використовуються для проведення ПЦР, – ампліфікатори – здатні збільшити фрагменти ДНК від кількох сотень до тисяч пар основ протягом кількох годин. За тією ж схемою ПЛР виявляє ген хвороби, розташований у геномі. Крім того, за допомогою цього методу виробляють безліч інших маніпуляцій з генетичним матеріалом: зміна основ, зрощування фрагментів ДНК та ін.

Переваги і недоліки
Головний плюс ПЦР-діагностики – можливість виявити захворювання на ранній стадії, задовго до появи перших симптомів. Цей метод дозволяє працювати практично з будь-якими біологічними матеріалами (кров'ю, сечею, мокротинням, зіскрібком епітеліальних клітин, навколоплідними водами тощо) та отримувати не лише якісний, а й кількісний результат.Іншими словами, провівши ПЦР-аналіз, можна встановити сам факт наявності збудника, і оцінити кількість копій його ДНК. Цей показник зручно використовуватиме контролю ефективності лікування. Якщо при повторному аналізі очевидно, що він зменшується, то терапія працює. Чутливість ПЦР-діагностики набагато вища, ніж імунохімічних та мікробіологічних методів. Цей аналіз дозволяє виділити сам збудник, а чи не продукти його життєдіяльності, які можуть зберігатися в організмі ще деякий час після хвороби. До того ж, він дозволяє визначати наявність інфекцій зі значною антигенною мінливістю, внутрішньоклітинних паразитів, а також тих мікроорганізмів, які не можна культивувати.Специфічність ПЦР-аналізу для всіх вірусних та більшості бактеріальних інфекцій досягає 100%. Він дозволяє виявити навіть поодинокі клітини патогенних мікроорганізмів у тих випадках, коли інші методи неспроможні, наприклад, при більшій частині хронічних персистуючих інфекцій, збудники яких можуть перебувати в організмі тривалий час (всі типи герпесу, токсоплазмоз, хвороба Лайма, хронічні вірусні гепатити та ін.). Розібратися, коли починається рецидив, млявий процес або одужання, можна лише за допомогою ПЦР-діагностики. Цей метод ідеально підходить для отримання відповіді на запитання, чи є у зразку той чи інший збудник. Набагато менше він придатний скринінгу, тобто. визначення, який саме мікроорганізм із багатьох інших присутній у пробі. Справа в тому, що ПЦР найкраще працює лише з однією або декількома парами праймерів.Занадто велика кількість підвищує ймовірність помилкових результатів. Зворотний бік медалі є і в основної переваги ПЦР-діагностики – її феноменально високої чутливості. Якщо в посуді для забору матеріалу, піпетках, пробірках та іншому лабораторному устаткуванні буде присутня хоча б найменша кількість «чужорідної» ДНК, аналіз може дати неправильний результат.Саме тому для ПЦР-діагностики важливо користуватися послугами надійної сертифікованої лабораторії, співробітники якої суворо дотримуються технологічного режиму – не порушують правила забору матеріалу, забезпечують його стерильність при зберіганні та транспортуванні. Декілька слів варто додати і про інтерпретацію результатів ПЦР-аналізу. Виявлені з його допомогою ДНК не завжди говорять про життєздатність патогенних мікроорганізмів і особливо про їх зв'язок з конкретним захворюванням. І хоча цей аналіз дає кількісну оцінку збудників, у багатьох випадках вибір лікування пацієнта залишається за лікарем, який повинен мати достатню кваліфікацію для того, щоб правильно оцінити отримані результати, спрогнозувати розвиток інфекції тощо.

Що далі?
ПЦР-діагностика продовжує розвиватися та удосконалюватися. Щороку на ринку з'являються десятки нових тест-систем, призначених для виявлення нуклеотидних послідовностей різних збудників. Існують розробки, які роблять ПЛР-метод дедалі доступнішим. Так, наприклад, мультиплексна ампліфікація дозволяє проводити дослідження відразу декількох фрагментів, що вивчаються, в одній пробірці, що істотно прискорює і здешевлює аналіз. Метод ПЦР вже давно зробив крок за межі традиційної лабораторної діагностики, а одним із найперспективніших напрямів його використання є персоналізована медицина. Відомо, що у пацієнтів іноді виникає індивідуальна непереносимість препаратів, пов'язана з появою небажаних токсичних ефектів чи алергічних реакцій.Це визначається генетично зумовленим ступенем активності того чи іншого цитохрому – білка печінки, який відповідає за метаболізм чужорідних речовин. Для того щоб визначити, який різновид цитохрому має пацієнт, і, відповідно, спрогнозувати, як він перенесе той чи інший препарат, перед початком терапії можуть проводити ПЦР-аналіз, який називають попереднім генотипуванням (англ. prospective genotyping).Крім того, сьогодні на зміну ПЦР поступово приходять методи, що ґрунтуються на ампліфікації не ДНК, а РНК, наприклад, метод ізотермічної ампліфікації нуклеїнових кислот (англ. nucleic acid sequencebased amplificaition, NASBA). Той факт, що мішенями при використанні NASBA-тесту є рибонуклеїнові кислоти, що становлять основу рибосоми, дає ряд переваг.Так, якщо в одній клітині збудника, наприклад хламідії або гонококу, міститься близько двох десятків ділянок ДНК, придатних для ПЦР-аналізу, кількість присутніх в ній рибосом вимірюється тисячами або навіть десятками тисяч. Отже, NASBA має ще більшу чутливість, ніж ПЦР. До того ж, якщо ДНК є досить стабільним матеріалом і її виявлення не завжди означає наявність життєздатних мікроорганізмів, РНК, навпаки, вкрай нестабільні. Вони швидко руйнуються при загибелі мікроорганізмів, тому NASBA тест дає більш точну картину поточного стану пацієнта, розвитку інфекції та результатів лікування.

В 1983 метод діагностики за допомогою ПЦР винайшов американський вчений Кері Мюлліс. За це через 10 років він отримав Нобелівську премію в галузі хімії.

Источник статьи журнал «Мистер Блистер».